Y Khoa Viet Nam

Trong những thập kỷ cuối của thế kỷ 20, sự ra đời của sinh học phân tử đã đem lại những đột phá về mặt công nghệ, tạo ra các phương tiện có giá trị cao để sử dụng trong chẩn đoán các bệnh về vi sinh vật nói chung cũng như các bệnh lý về viêm gan virus nói riêng, nhờ đó mà có rất nhiều bệnh được điều trị triệt để.

Ngày nay, việc ứng dụng sinh học phân tử trong chẩn đoán điều trị bệnh viêm gan do virus nói chung và bệnh do viêm gan virus C ngày càng trở lên quan trọng, chúng trở thành các chỉ định xét nghiêm bặt buộc trong điều trị viêm gan virus C nhất là viêm gan C kháng thuốc, chúng đặc biệt hữu ích trong việc thiết lập điều trị, thay đổi điều trị, đánh giá về virus học cũng như sự kháng thuốc của virus viêm gan C. Hiện tại, có một số kỹ thuật sinh học phân tử sau được ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị viêm gan virus C.

1. Các kỹ thuật khuếch đại mục tiêu.

Nguyên tắc cơ bản của các kỹ thuật khuếch đại mục tiêu là tổng hợp một số lượng lớn bản sao của các bộ gen virus (được gọi là các sản phẩm khuếch đại PCR, LCR, amplicon) trong một phản ứng men theo chu kỳ

Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) phát hiện HCV RNA: phương pháp này dùng nhiều nhiệt độ khác nhau và chung một enzym polymerase chịu nhiệt. Các sản phẩm khuếch đại là các DNA mạch đôi. PCR được áp dụng cho các virus DNA trực tiếp, tuy nhiên với virus RNA (như HCV) một bước sao chép ngược là cần thiết, để tổng hợp DNA bổ trợ dùng làm khuôn trong phản ứng PCR.

Khi mỗi chu kỳ PCR hoàn tất, số lượng bản sao được nhân đôi, sau n chu kỳ 2n bản sao của mỗi phân tử ban đầu được tổng hợp về mặt lý thuyết. Việc phát hiện các sản phẩm khuếch đại dựa vào phương pháp lai đặc hiệu.Việc định lượng được dựa vào khuếch đại cạnh tranh của khuôn virus với một lượng chuẩn tổng hợp thêm vào mỗi ống phản ứng.

PCR thời gian thực phát hiện HCV RNA: nguyên tắc kỹ thuật này là nhằm phát hiện sự tổng hợp sản phẩm khuếch đại và suy ra số lượng bộ gen virus trong mẫu lâm sàng từ lúc khởi đầu chứ không chờ đến cuối phản ứng. Kỹ thuật này nhạy hơn PCR cổ điển, kỹ thuật này có thể được tự động một phần hoặc tự động hoàn toàn.

Khuếch đại qua trung gian phiên mã (TMA) phát hiện HCV: đây là cách khuếch đại acid nucleic thế hệ mới, thuộc hệ khuếch đại phiên mã RNA bằng cách dùng 2 enzym thực hiện phản ứng: T7 RNA polymerase và men phiên mã ngược. TMA là phương pháp đẳng nhiệt, toàn bộ phản ứng thực hiện cùng một nhiệt độ.

Sau khi phân giải vỏ ngoài và capsid của virus, bộ gen virus bị bắt giữ bởi bộ dò oligoglicosid và gắn kết vào các vi hạt từ (magnetic microparticles). Khuếch đại bao gồm sự sản xuất đẳng nhiệt tự xúc tác của phiên mã RNA với 2 enzym. Mỗi RNA được tổng hợp mới vào lại quá trình TMA và dùng như một khuôn cho một vòng sao chép mới gây khuếch đại RNA mục tiêu theo hàm số mũ.

2. Các kỹ thuật khuếch đại tín hiệu.

Trong các kỹ thuật khuếch đại tín hiệu, bộ gien virus lúc đầu được lai vào một giá bằng các bộ dò oligonucleotid bắt giữ đặc hiệu, sau đó tín hiệu phát ra bởi các lai được khuếch đại và đo lường. Có hai kỹ thuật hay sử dụng:

Phương pháp bắt giữ lai (hybrid capture)

Kỹ thuật DNA nhánh (Branched DNA technology)

3. Phân tích trình tự bộ gen HCV.

Phân tích trình tự bộ gen virus nhằm vào việc xác định các trình tự ký tên ( điều này được dùng để phân loại các chủng virus theo lợi ích lâm sàng, gọi là kiểu gen của virus ) hoặc các thay thế acid amin ở các vị trí đặc biệt ( điều này được dùng để xác định các acid amin đã biết liên quan đến sự kháng thuốc ). Phân tích trình tự bộ gen dựa vào việc xác định trình tự trực tiếp, cung cấp toàn bộ trình tự của đoạn được phân tích, hoặc các kỹ thuật thay thế nhận dạng các trình tự đặc hiệu ở các vị trí cho sẵn.Có hai kỹ thuật thường áp dụng:

Xác định trình tự trực tiếp của các sản phẩm khuếch đại HCV PCR: được thực hiện sau phản ứng xác định trình tự trong một thiết bị xác định trình tự DNA tự động. Thiết bị có thể dùng để xác định trình tự nucleotid chính xác và trịnh tự acid amin suy ra của đoạn được phân tích. Điều này được áp dụng vào việc phát hiện các loại hình đột biến.

Lai ngược của các sản phẩm khuếch đại HCV PCR: việc xác định trình tự trực tiếp tốn nhiều công sức và chỉ thực hiện ở viện nghiên cứu đặc biệt, do đó cho đến nay có nhiều kỹ thuật mới được phát triển để áp dụng cho lâm sàng, trong đó được ứng dụng nhiều nhất là phương pháp dựa vào lai ngược các sản phẩm khuếch đại PCR.

Trong các xét nghiệm này, khuếch đại PCR của vùng được quan tâm theo phương pháp lai với các bộ dò oligonucleotid cố định vào một pha rắn. Các bộ dò này được thiết kế bổ trợ cho nhiều trình tự khác nhau.

Tóm lại, với sự ra đời và cải tiến không ngừng của kỹ thuật sinh học phân tử, các xét nghiệm này được sử dụng rộng rãi để chẩn đoán, giúp tiên lượng cũng như quyết định phương hướng điều trị viêm gan mạn do virus C, do đó khi có xét nghiệm anti HCV dương tính, thì các xét nghiệm sinh học phân tử sau cần làm đó là định tính HCV RNA nhằm xác định tình trạng nhiễm virus viêm gan C;

định lượng HCV RNA nhằm tiên lượng tình trạng nhiễm HCV, số lượng HCV RNA càng cao bệnh càng tiến triển và càng khó đáp ứng với điều trị và cuối cùng là xác định kiểu gen HCV RNA giúp tiên lượng cho quá trình điều trị, nếu kiểu gen 2 và 3 thì thời gian dự kiến điều trị sẽ thấp hơn kiểu gen 1